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★ 線粒體Cyt b基因?qū)欧N穿山甲鑒別力的分析

韓松霖1，馬躍1,2，李波1,2,3，劉微1,2，穆佳童1，徐艷春1,2,3，楊淑慧1*

（1. 東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2. 國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物檢測(cè)中心，哈爾濱，150040；3. 國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)物保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，哈爾濱，150040）

論文摘要

為優(yōu)化穿山甲的分子鑒定方法，采用9種穿山甲54條Cyt b基因完整序列，評(píng)估了MEGA11軟件中的7種模型和23種堿基替換類型所估算的遺傳距離的物種分辨率、Cyt b基因全序列及各區(qū)域的鑒別力。結(jié)果表明：K2P模型和p-distance模型基于顛換（Tv）計(jì)算的遺傳距離具有最優(yōu)的物種分辨率；Cyt b基因全序列有較好的物種鑒別能力，其中，第301 ~ 400號(hào)和第851 ~ 950號(hào)的2個(gè)堿基序位片段組合時(shí)具有最高的物種分辨率，是鑒別9種穿山甲的最佳理論區(qū)段?，F(xiàn)有的方法中推薦使用Kocher等的引物。今后在研發(fā)中采用多重PCR結(jié)合高通量測(cè)序?qū)Χ嗥谓M合進(jìn)行分析，將會(huì)大幅提高穿山甲的鑒別力。

論文速覽

穿山甲主要分布于亞洲、非洲的熱帶及亞熱帶地區(qū)，2023年，Gu et al.通過(guò)對(duì)海關(guān)查獲的穿山甲進(jìn)行群體基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的物種，命名為神秘穿山甲（Manis mysteria），使其成為第9種穿山甲或第5種亞洲穿山甲，但其分布地區(qū)目前仍不清楚。

近年來(lái)，大量穿山甲制品自非洲、東南亞通過(guò)走私流入亞洲和歐美市場(chǎng)，其中穿山甲甲片是海關(guān)查獲最多的產(chǎn)品。在打擊走私過(guò)程中，對(duì)查獲的甲片進(jìn)行物種鑒定是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究以線粒體Cyt b基因序列為對(duì)象，探究適合穿山甲物種鑒定的最佳遺傳距離計(jì)算方法，評(píng)估并篩選鑒別力較優(yōu)的區(qū)段，為建立可靠的穿山甲物種鑒定方法提供參考。

● 兩種滑窗長(zhǎng)度的Cyt b基因序列在種內(nèi)遺傳距離（Intra-d）95%置信上限和種間距離（Inter-d）95%置信下限之差的動(dòng)態(tài)變化

● 片段組合種內(nèi)及種間遺傳距離置信區(qū)間統(tǒng)計(jì)

MY. 神秘穿山甲；PE. 中華穿山甲；JA. 馬來(lái)穿山甲；ST. 南非穿山甲；CR. 印度穿山甲；GI. 大穿山甲；TR. 樹(shù)穿山甲；CU. 菲律賓穿山甲；PT. 長(zhǎng)尾穿山甲。

● 部分序列片段的鄰接樹(shù)

研究結(jié)果顯示，采用K2P  Tv方法計(jì)算遺傳距離對(duì)9種穿山甲的Cyt b基因片段鑒別效率最高。沿Cyt b基因，大部分片段的物種分辨率都低于全長(zhǎng)Cyt b基因的分辨率（0.05），如在100 bp的滑窗中檢測(cè)到751 ~ 850號(hào)堿基間序列最為保守，其物種分辨率僅為全長(zhǎng)序列差值的50%；但另一些100 bp的短片段也具有較高的鑒別力，如堿基序位在851 ~ 950號(hào)的片段，其物種分辨率是Cyt b全序列的1.22倍；類似的片段還有堿基序位為551 ~ 650號(hào)、301 ~ 400號(hào)時(shí)，物種分辨率分別是Cyt b全序列的1.2倍和1.14倍。因此，如果采用多片段復(fù)合擴(kuò)增和擴(kuò)增子高通量測(cè)序技術(shù)，把多個(gè)這樣的片段同時(shí)進(jìn)行分析，能夠去掉很多噪聲，提高鑒別力。且自401號(hào)堿基序位后無(wú)法鑒別部分物種，必須避免使用只包含該部分堿基的片段，故而物種分辨率達(dá)全長(zhǎng)序列的1.2倍的［（301 ~ 400） （851 ~ 950）］號(hào)堿基序位的片段組合為最佳理論選擇?；谶z傳距離的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也直觀地支持了這一結(jié)論，這為設(shè)計(jì)更有效的穿山甲鑒定方法提供了依據(jù)。已發(fā)表的幾種使用短片段的穿山甲鑒定方法中Kocher et al.設(shè)計(jì)的引物得到的長(zhǎng)度為307 bp（96 ~ 402號(hào)堿基序位）的序列范圍包含兩段高分辨率區(qū)域，推測(cè)鑒定效果近似或略優(yōu)于Cyt b全長(zhǎng)序列；L14724/ H15149引物得到的長(zhǎng)度為402 bp（1 ~ 402號(hào)堿基序位）的序列包含0 ~ 100及200 ~ 300號(hào)堿基兩段低鑒別力區(qū)域，推測(cè)分辨率不及上述方法；王辰等設(shè)計(jì)的一種產(chǎn)物為131 bp（70 ~ 200號(hào)堿基序位）長(zhǎng)度的引物基本位于低分辨率區(qū)域，鑒別力有限。

● 基金項(xiàng)目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（2572020DR10）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32170517）。

● 第一作者簡(jiǎn)介：韓松霖（1999—），男，碩士研究生；主要從事動(dòng)物學(xué)與保護(hù)生物學(xué)研究。E-mail：185645457@qq.com

● *通信作者：楊淑慧，E-mail：474568251@qq.com